دانلود پایان نامه بررسی عفونت ریوی مایکوپلاسمایی ناشی از مایکوپلاسما مایکوئیدس واریته مایکوئیدس و مایکوپلاسما کاپری کولوم واریته کاپری کولوم در گوساله ها و بزهای کشتار شده به روش PCR

در این تحقیق به پایان نامه بررسی عفونت ریوی مایکوپلاسمایی ناشی از مایکوپلاسما مایکوئیدس واریته در گوساله ها و بزهای کشتار شده به روش PCR پرداخته شده، عفونت پلوروپنوموني واگير،‌ بيماري تحليل برنده تنفسي است كه با جاي گرفتن در طبقه‌بندي بيماريهاي سازمان جهاني كنترل بيماريهاي واگير، لزوم و اهميت شناسايي آن مشخص شده است. عامل اصلي اين بيماري، گونه مايكوپلاسما مايكوئيدس مي‌باشد كه تايپ كلوني كوچك آن[۱] بطور اختصاصي به گله‌هاي گاو، خسارات فراواني ناشي از همه‌گيري گسترده و مرگ و مير فراوان تحميل كرده است.

تايپ كلوني بزرگ اين گونه[۲] همراه با دو گونه ديگر بنامهاي مايكوپلاسما كاپري كولوم كاپري كولوم[۳] و مايكوپلاسما مايكوئيدس كاپري[۴] فرم غيركلاسيك پلوروپنوموني واگير را در گله‌هاي گوسفند و بز بوجود آورده‌اند. اين بيماري در فرم كلاسيك، که عامل آن مايکوپلاسما کاپري کولوم کاپري پنوموني[۵] شناخته مي‌شود، خسارات اقتصادي سهمگيني در گله‌هاي بز و گوسفند موجب گرديده است.

از آنجائيكه منطقه خاورميانه جزو مناطق مشكوك به آلودگي پلوروپنوموني واگير محسوب مي‌شود، حفظ وضعيت عاري بودن از عفونت در اين منطقه، مشكل يا تقريبا غيرممكن بوده و نيازمند بازنگري درراهبردهاي بكار رفته به منظور تشخيص و كنترل اين عفونت‌هاست. عدم برخورداري از خصوصيت پاتوگونوميك تشخيصي و پاتولوژيكي‌، مسير بيماريزايي ناشناخته و تنوع فنوتيپي بسيار پيچيده ارگانيسم در مواجهه با دستگاه ايمني ميزبان، بر مشكل شناسايي آن افزوده است. علاوه بر  اين ، ابقا طولاني مدت باکتري در محل عفونت و وجود ناقلين بدون علامت‌، برنامه كنترل بيماري را با چالش روبرو كرده است.

از اين رو، شناسايي و بكارگيري روشهاي تشخيصي و تفريقي گونه‌هاي كلاستر مايكوپلاسما مايكوئيدس كه هركدام استراتژي جداگانه اي در برخورد با عفونت گله‌ها دارند، از اهميت ويژه‌اي برخوردار است.

از آنجايي كه مايكوپلاسماهاي پاتوژن در محيط كشت به سختي رشد مي‌كنند، استفاده  متداول از روش كشت و جداسازي، شناسايي عفونت گله‌ها را با مشكل روبرو كرده است.

از طرف ديگر، عمدتا به دليل تشابه آنتي ژنتيكي بين گونه‌هاي كلاستر مايكوئيدس و ساير گونه‌هاي مايكوپلاسما، روشهاي سرولوژي از دقت و ويژگي كافي در تمايز گونه‌ها برخوردار نيستند. لذا به رهيافت روش‌هاي مولكولي مانندPCR بعنوان روشي سريع،  دقيق و با حساسيت و ويژگي مطلوب در كنترل عفونت گله‌ها، توجه ويژه‌اي مي‌شود.

هدف از اين مطالعه، بررسي عفونت‌هاي تنفسي ناشي از كلاستر مايكوئيدس در  گله‌هاي نشخواركنندگان از طريق كشت و PCR مي‌باشد.

چكيده

كلاستر مايكوپلاسما مايكوئيدس در برگيرنده مهمترين پاتوژنهاي تنفسي نشخواركنندگان است كه ساليانه، خسارات اقتصادي سنگيني بر صنعت دامپروري كشورهاي جهان وارد مي‌كند. اخيرا شيوعهاي بازپديدي از عفونتهاي پلوروپنوموني نشخواركنندگان در منطقه خاورميانه گزارش شده است. در اين شرايط تعيين وضعيت گله‌هاي كشور از نظر آلودگي به گونه‌هاي پاتوژن اين كلاستر، از اهميت خاصي برخوردار است. هنوز گزارشي از شناسايي و جداسازي گونه‌هاي درگير از عفونت پلوروپنوموني در ايران بدست نيامده است. عدم برخورداري از خصوصيت پاتوگونوميك در نمونه‌هاي باليني و دشواريهاي فراوان جداسازي ميكروارگانيسم، به ضرورت شناسايي و بكارگيري روشهاي تشخيصي جايگزين افزوده است.

علاوه بر اين، دستيابي به روشي كاربردي و سريع، در تشخيص عفونتهاي تنفسي گله‌ها و تخميني از وضعيت عفونت در ايران، مدنظر اين تحقيق بوده است.

در اين مطالعه‌، ۱۰۰ نمونه ريه با ضايعات مشكوك به عفونتهاي تنفسي مايكوپلاسمايي از ۱۰۰  گله مشكوك (۵۰ گله گاو،۳۰ گله گوسفند،۲۰ گله بز) در اطراف كرمانشاه ، در سالهاي ۱۳۸۶-۱۳۸۴ جمع آوري شدند. ضايعات ماکروسکوپي شامل کبدي شدن ريه‌ها با زخم‌هاي خاکستري و سفيد(جامد شدن) و ظاهر منقوط با يا بدون فيبرين بودند. نمونه‌ها در محيط کشت PPLO براث و آگار کشت داده شدند. پس از پاساژهاي متعدد،از ۲۳ گله مشکوک،تک کلوني تخم‌مرغي شکل مايکوپلاسما جداشد(۱۱ گله گاو،۸ گله گوسفند،۴ گله بز).

اما در واكنش, PCR63  گله عفونت مايكوپلاسماي تنفسي نشان دادند (۳۷ گله گاو، ۱۷ گله گوسفند، ۹ گله بز).

اين امر، مبين اين نكته است كه عليرغم اينكه جداشدن عامل مايكوپلاسمايي از نمونه‌ها در محيط كشت، اساس تعيين وضعيت عفونت‌هاي مايكوپلاسمايي قلمداد مي‌شود، اما  سخت‌رشد بودن گونه‌هاي مورد مطالعه در محيط كشت و عدم دستيابي سريع به نتيجه، كارآيي اين روش تشخيصي را در پايش متداول عفونت گله‌ها زير سوال برده است.

علاوه بر اين، بكاربردن آنتي بيوتيكهاي متنوع در دوره درمان و از بين رفتن ميكروارگانيسم در خلال جمع آوري نمونه، ‌نتايج رشد در محيط كشت مايكوپلاسما را دستخوش تغيير داده است.

از اين رو،‌ استفاده از روشهاي مولكولي PCR بعنوان يك روش كاربردي،  حساس و سريع توصيه مي‌شود. پس از استخراج ‌DNA نمونه‌ها به روش فنل کلروفورم و جدا كردن نمونه‌هاي آلوده به مايكوپلاسما از طريق PCR ، با استفاده از پرايمر اختصاصي كلاستر مايكوئيدس نمونه‌هاي مايكوپلاسمايي تحت واكنش PCR قرار گرفتند.

باند bp 548، تنها در نمونه كنترل ( سويه F38) ديده شد. به منظور كنترل روند واكنش، نمونه‌ها با پرايمر اختصاصي مايكوئيدس كلوني بزرگ و پرايمر اختصاصي آگالاكتيه، به طور جداگانه PCR شدند كه نتيجه اين آزمايش، يافته‌هاي آزمايش قبلي را تائيد مي‌كرد.

اگر چه اين تحقيق نشان داد كه عامل عفونتهاي تنفسي مشكوك در نمونه‌هاي مورد مطالعه نمي‌تواند از گونه‌هاي كلاستر مايكوئيدس باشد، منتهي تخمين ميزان عفونت در گله‌هاي مورد مطالعه، احتياج به تحقيقات وسيعتر با جمع‌آوري تعداد نمونه‌هاي بيشتر در مطالعات بعدي دارد.

فصل اول: كليات

۱- تاريخچه

عامل اصلي بيماري پلوروپنوموني واگير گاوان[۶] ـ كه امروزه به نام مايكوپلاسما مايكوئيدس مايكوئيدس بيوتايپ كلوني كوچك[۷] شناخته مي‌شود- در سال ١٨٩٨ براي اولين بار توسط نوكارد[۸] وروكس[۹] شناسايي گرديد. در آن زمان، اولين نام نهاده شده بر اين اجرام، پلوروپنوموني بود كه بعد از اين كه اجرامي با خصوصيت مشابه اين ميكروارگانيسم از منابع ديگر به دست آمد، بنام اجرام شبه پلوروپنوموني نام‌گذاري شد. ٦٠ سال بعد، نواك نام مايكوپلاسما را به عنوان نام ژنريك اجرامي كه فاقد ديواره سلولياند، پيشنهاد كرد (۴۵).

٢- خصوصيات كلي مايكوپلاسما

مايكوپلاسماها، جزو كوچك‌ترين پروكاريوت‌هايند (μm١٥-٠)  كه قادرند از فيلترهاي مخصوص باكتري (μm٤٥-٢٢/٠) عبور كنند. اين اجرام به دليل فقدان ديواره سلولي، اشكال پلي‌مورفيك دارند و به اشكال كروي (μm٣/٠-٩/٠)، رشته‌اي (تا μm١)،گلابي شكل، شاخه‌اي و مارپيچي  در زير ميكروسكوپ الكتروني ديده مي‌شوند. در واقع، بيشتر شبيه به فرم L باكتري‌ها مي باشند.ارگانيسم از سه ارگانل شامل غشا سلولي، ريبوزوم و مولكول حلقوي DNA تشكيل شده است. تصوير مايكوپلاسما در زير ميكروسكوپ الكتروني، شبيه فيلامان (بطري) است كه از دو انتها طويل شده است. اين اندامك‌‌هاي انتهايي[۱۰]، محل اتصال به غشا يوكاريوت است كه داراي يك ساختمان مركزي ميله مانند[۱۱] مي‌باشد و توسط غشا احاطه شده است (۷۰).

مجموعه خصوصياتي مانند عبور از صافي‌هاي مخصوص پالايش باكتري، عدم حساسيت به آنتي‌بيوتيك‌ها و دشواري‌هاي رشد، آن‌ها را شبيه به ويروس‌ها كرده است. ولي وجود محتواي ژنتيكي DNA (٧-٥/١)% و RNA (١٧-٨)% كه توسط غشاي پلاسمايي سه لايه‌اي حفاظت شده است، سبب تمايز آن‌ها از ويروس‌ها، كلاميديا وريكتزياها مي‌شود. به دليل دارا بودن حداقل ژن‌هاي لازم براي تكثير مستقل- كه در حدود  تا  محتواي ژنتيكي E.coli است ـ نيازمند موجودات زنده براي تكثير و زنده‌ماني نمي‌باشند (۵۰).

ولي به هر حال تعداد كم ژن‌ها، منجر به رشد بطئي، ونياز قابل توجه به ميزبان براي تامين برخي از مواد مغذي و بقا شده است. به همين علت بسياري از مايکوپلاسماها به عنوان انگل‌هاي سطحي در غشا مخاطي دستگاه تنفس چشم، ادراري تناسلي، بافت پستاني و مفاصل شناخته شده اند و به ندرت بافت‌ها را مورد تهاجم قرار مي‌دهند (۴۷).

البته انتشار آن‌ها به اندام‌هاي مختلف بيانگر وجود حداقل يك عفونت گذراست. به طور كلي، تنها برخي گونه‌هاي مايكوپلاسما و احتمالاً‌ سويه‌هاي خاص، تمايل بيشتري به بعضي بافت‌ها يا اندام‌ها دارند، هر چند كه اين تمايل به معناي حذف كامل تمايل به ساير بافت‌ها نمي‌باشد. اغلب مايكوپلاسماها، به عنوان آلوده كننده محيط كشت سلولي شناخته مي‌شوند که تشخيص و کنترل آلودگي آنها مشكل است (۵۰).

مايكوپلاسماها با استفاده از توانايي حركت خود كه به صورت سرخوردن است[۱۲]، خود را به سلول‌هاي هدف مي‌رسانند. اين حركت كند بوده و تحت تاثير آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي مهار مي‌شود (۷۴).

بسياري از مايكوپلاسماها، بي‌هوازي اختياري بوده و بعضي به صورت مطلوب در اتمسفري با ١٠ -٥% CO2 رشد مي‌كنند. مايكوپلاسماهاي بي‌هوازي غيرپاتوژن در شكمبه گوسفند و گاو يافت مي‌شود (۲).

۳-مقاومت مايكوپلاسماها

اين اجرام توانايي توليد ديواره سلولي پلي‌مورفيك و پپتيدوگليكاني را دارند و از همين رو، به آن‌ها باكتري‌هايي  با نقص ديواره سلولي[۱۳] اطلاق مي‌شود. آنتي‌بيوتيك‌هايي كه بر روي ديواره سلولي اثر مي‌كنند،(دسته بتالاکتامز) مانند پني‌سيلين و سفالوسپورين، آن‌ها را از بين نمي‌برند. اگر چه نسبت به آنتي‌بيوتيك‌هايي كه بر روي سنتز پروتئين اثر دارند (مانند تتراسايكلين) ‌حساسند، ولي اين آنتي‌بيوتيك‌ها در بدن حيوانات زنده زياد موثر نيستند، زيرا گاهي غلظت كافي آن‌ها به سطح اپي‌تليومي كه توسط مايكوپلاسماها احاطه شده است، نمي‌رسد. از خصوصيت مقاوم بودن به پني‌سيلين و استات تاليم، براي جلوگيري از رشد ميكروب‌هاي آلوده كننده محيط كشت استفاده مي‌شود (۷۲).

در آزمايش‌هاي تجربي، مايكوپلاسماها به شوك اسموتيك، ضدعفوني كننده‌هاي محيطي، الكل، گرما و خشكي، آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي وکامپلمان حساس مي‌باشند. دماي °C٥٥ به مدت ‘١٥ و °C٦٠ به مدت ‘٥ آن‌ها را از بين مي‌برد. براي مثال گونه مايكوئيدس مايكوئيدس در خارج از بدن حيوان بيش از چند ساعت، قادر به ادامه حيات نمي‌باشد، ولي در محل عفونت تا مدت‌ها باقي مي‌ماند. از گاوهايي كه در ١٠ ماه پيش به بيماري پلوروپنوموني واگير مبتلا بوده‌اند، ميكروارگانيسم جدا شده است (۷۲). سكوستراهاي ريوي منبع بالقوه‌اي از آلودگي  هستندو ارگانيسم را براي زماني به مدت ٣ سال نگهداري مي‌كنند. به همين علت، كانون‌هاي عفونت در اكثر موارد، حيوانات بهبود يافته‌اند. تركيبات ديگر از قبيل جفت و ادرار نيز مي‌توانند ارگانيسم‌ها را براي مدت طولاني زنده نگه‌دارند. گزارش شده است كه يونجه آلوده به ميكروارگانيسم تا مدت ١٢٤ ساعت، قادر به انتقال آلودگي است. هم‌چنين در ريه منجمد تا چندين ماه و در محيط كشت خشك شده در خلا، چندين سال زنده مي‌ماند. فنل ١%، فرمالين ٥/٠% و كلريد جيوه ١% به مدت چند دقيقه ميكروارگانيسم را از بين مي‌برند (۴۴).

۴-طبقه‌بندي مايكوپلاسماها

با استفاده از آناليز توالي ژن ۱۶S-rRNA، تصور مي‌شود كه مايكوپلاسماها در حدود ٦٠٠ ميليون سال قبل با از دست دادن قسمت‌هاي غير ضروري ژنوم خود، از جمله ژن‌هاي سنتز ديواره سلولي از باكتري‌هاي گرم مثبت و مشخصاً كلستريديومها مشتق شده‌اند (۵۰).

از نظر فيلوژني، مايكوپلاسماها به كلاس Mollicutes، رده Mycoplasmatales و خانواده Mycoplasmatacea تعلق دارند. كلاس Mollicutes، بيش از ١٠٠ گونه از مايكوپلاسماهاي گياهان، مهره‌داران و حشرات را در بر مي‌گيرد و از ٥ جنس تشكيل شده است كه در ميان آن‌ها، مايكوپلاسما، اوروپلاسما[۱۴] و آنئروپلاسما[۱۵]، بيشترين ميزبانان را در انسان و حيوان دارا هستند. (جدول٢)

بر اساس آناليز توالي قطعه V2 از ژن ۱۶S-rRNA، مايكوپلاسماها به ٤ دسته تقسيم‌بندي شده‌اند: ١ـ پنوموني، ٢ـ هومي‌نيس[۱۶]، ٣ـ اسپيروپلاسما و ٤ـ آئروپلاسما.

سه گونه مايكوپلاسماي بيماري‌زا در انسان، پنوموني،‌هومي‌نيس و اوروپلاسما هستند كه به ترتيب اختلالات تنفسي، و يوروجنيتال را به وجود مي‌آورند.بيماري‌زاترين گونه‌ها در نشخواركنندگان، متعلق به كلاستر مايكوئيدس است كه در دسته اسپيروپلاسما جاي گرفته است (۹) .اعضا اين كلاستر كه عمدتاً مسئول عفونت‌هاي تنفسي هستند، از نظر خصوصيات آنتي‌ژنتيكي و فنوتيپي، وجه اشتراك زيادي دارند كه تمايز و تفكيك آن‌ها را در تست‌هاي متعارف آزمايشگاهي با چالش روبه‌رو مي‌كند. جدول ٢ به معرفي اعضا اين كلاستر و ميزبانان اصلي آن‌ها پرداخته است. در ميان اعضا، مايكوپلاسما مايكوئيدس مايكوئيدس بيوتايپ كلوني بزرگ[۱۷] و مايكوپلاسما كاپري‌كولوم كاپري‌پنوموني[۱۸] از مهم‌ترين پاتوژن‌هاي شناخته شده در نشخواركنندگان هستند. بيماري پلوروپنوموني واگير گاوان و پلوروپنوموني واگير بزان، دو بيماري مطرح شده در فهرست  A و B سازمان جهاني كنترل بيماري‌هاي واگير جانوري اند كه تشخيص و گزارش وقوع آن‌ها، جهت احراز اقدامات فوري اجباري است.

طبقه‌بندي كلاستر مايكوئيدس

اعضا اين كلاستر شامل مايكوپلاسما مايكوئيدس مايكوئيدس كلوني كوچك (MmmSC)، مايكوپلاسما مايكوئيدس مايكوئيدس كلوني بزرگ (MmmLC)، مايكوپلاسما كاپري‌كولوم كاپري‌پنوموني (Mccp)، مايكوپلاسما كاپري‌كولوم كاپري‌كولوم (Mcc)، مايكوپلاسما مايكوئيدس كاپري (Mmc)، سروتيپ ٧ سويه گاوي (M.bsg7)، مايكوپلاسما پوتري‌فيكنس (M.putrificans)، مايكوپلاسما كووتي (M.cowetti) و مايكوپلاسما يستي (M.yeasti) مي‌باشند. دو گونه آخر جز مايكوپلاسماهاي ساپروفيت اند كه بيماري‌زايي آن‌ها در شرايط عادي در نشخواركنندگان نامعلوم است و پوتري‌فيكنس از مبتلايان به سندروم نقص ايمني انسان نيز جدا شده است (۴۷).

خسارات اقتصادي ناشي از بيماري‌زايي و حضور اعضا اين كلاستر در نشخواركنندگان، از اهميت زيادي برخوردار است، به طوري كه بيماري ناشي ازMmmSC -پلوروپنوموني واگير گاوان (CBPP)- از مهم‌ترين معضلات مطرح اقتصادي در صنعت دامپروري در آفريقا و اخيراً در اروپاست كه براي ساليان متمادي كشورهاي زيادي را درگير كرده است)۴۵).

هم‌چنين در حال حاضر، پلوروپنوموني واگير بزان (CCPP)، بيشترين خسارات اقتصادي را در آفريقا ايجاد مي‌كند كه پس از طاعون نشخواركنندگان كوچك[۱]، دومين بيماري قابل توجه را در گله‌هاي بز را به وجود آورده است (۱۷).

MmmLC،Mcc و Mmc سندروم MASKePs[2] را در گله‌هاي گوسفند و بز ايجاد مي‌كنند كه متداول‌ترين تظاهرات بيماري با تورم پستان باليني، التهاب مفصل، سپتي سمي، تورم قرنيه و پلوروپنوموني در بالغين همراه است. در بزغاله‌ها پنوموني، سپتي‌سمي و التهاب  عمومي مفاصل در اين سندروم ديده مي‌شود (۵۲).

بيماري‌زايي bsg7 يا Msp7 كه در عفونتهاي همزمان با سويه P650 آغاز مي‌شود، هنوز در دست تحقيق است. اخيراً همه‌گيري‌هايي در گله‌هاي گاو با علايم سقط، التهاب مفاصل و تورم پستان در استراليا ديده شده كه اين عامل از آن‌ها جدا گرديده است (۲۶). گونه پوتري‌فيكنس عامل تورم پستان والتهاب مفاصل شناخته شده، ولي آنتي‌ژنيستي اين گونه و M.cowetti و M.yeasti با ساير اعضا كلاستر  به طور بارزي متفاوت است، لذا به طور معمول به عنوان اعضا كلاسيك كلاستر مايكوئيدس محسوب نمي‌شوند. به هر حال، آناليز فيلوژني ژن ۱۶S-rRNA، آن‌ها را در يك كلاستر قرار داده و نشان داده است كه قرابت ژنتيكي گونه‌هاي   cowetti و yeasti، ٧/٩٩% و با پوتري‌فيكانس ٩/٩٨% است (۵۲).

۶-فيلوژني

اولين قدم در طبقه‌بندي موليكيوتها به وسيله روش‌هاي ملكولي و ايمني شناسي برداشته ميشود. تاکنون اطلاعات تاكسونومي با ارزشي به دست آمده است، اما از روند تكامل اطلاعات زيادي در دست نميباشد. اخيراً، بررسي ارتباط‌هاي فيلوژني موليكيوتها بر روي مناطق ريبوزومي RNA كه بسيار حفاظت شده است، متمركز گرديده است. اين مناطق حفاظت شده به نسبت كل ژنوم مايكوپلاسما، بسيار كمتر دستخوش تغيير مي‌شوند. امروزه توالي كامل ٤٥٠ باكتري، شناخته شده است (۵۰).

ويسبرگ[۳] در مطالعه‌اي، توالي كامل ژن۱۶S-rRNA را در بالغ از ٤٠ گونه موليكيوتها و باكتري‌هاي ديواره‌دار تعيين كرد. اين تحقيقات نشان داد كه موليكيوتها در گروه استرپتوكوكوس ـ لاكتوباسيل ـ باسيل كه باكتري‌هاي G+ با محتواي اندک G+C هستند، قرار ميگيرند و ازنياکان كلستريديوم‌ها مشتق شده‌اند.

آناليز توالي ژنrRNA نشان مي‌دهد كه گونه‌هاي   Mmm و M.capricolum متعلق به يكي از ٥ گروه موليكيوتهاهستند كه در دسته اسپيروپلاسماها جای گرفته اند (۷۱).نتيجه اين انشعاب، كاهش در سايز ۱۰۰۰KD ژنوم به KD٥٠٠ در جنس مايكوپلاسما و اوروپلاسما است (۴۷).

ساختمان مايکوپلاسما مايکوئيدس

مانند ساير موليكيوتها، Mmm در خلال تكامل، ژن‌هاي سازنده ديواره سلولي خود را از دست داده و يك غشا سه لايه‌اي، جسم سلولي را كه شامل عناصر ريبوزومي و محتويات هسته می باشد، محدود كرده است. اندامك‌ انتهايي آن كه به مرحله اتصال و چسبيدن ارتباط دارد، برخلاف گونه گاليناروم و پنوموني در Mmm شناخته نشده است. به هر حال رادول[۴] از يك ارگانل داخل سيتوپلاسمي كه تا گوشه‌ها امتداد يافته است، نام‌برده است. اين ارگانل، تنها در شرايط توني‌سيتي شديد و منابع غير محدود انرژي تشكيل مي‌شود و اهميت آن نامعلوم است (۷۱).

به جاي ديواره پپتيدوگليکاني ساير باكتري‌ها، Mmm داراي يك ساختار كپسول مانند است كه از غشا يك لايه‌اي به ضخامت ٣٠ نانومتر تشكيل شده است. آناليز شيميايي نشان داده است كه اين كپسول حاوي گالاكتان، پلي‌مري از جنس مونوساكاريد گالاكتوز ، و باندهاي B(1-6) است. اين كپسول، ٩٠% از كل  ساختمان كربوهيدراتي از مايكوپلاسماي رشد كرده در محيط كشت را تشكيل مي‌دهد که با افزايش سرعت رشد و غلظت گلوكز، توليد آن افزايش مي‌يابد. كپسول گالاكتان در محيط براث و بافت‌هاي حيوان مبتلا، به صورت شعاعي انتشار مي‌يابد و در عفونت‌هاي شديد درگردش خون، ريه، مايع پلور، و ادرار در مقادير زياد يافت مي‌شود (۷۱).

كپسول گالاكتان داراي دترمينانت‌هاي آنتي‌ژنتيكي است كه با ويروس واكسينا و پلي‌ساكاريدهاي ساير باكتري‌ها، گياهان و حتي بافت نرمال ريه تشابه آنتي‌ژنتيكي دارد.

به نظر مي‌آيد ساختار كپسول، در بين ساير اعضا كلاستر متفاوت باشد ، پلي‌ساكاريدي كه از Mmc به دست آمده شامل گلوكان و پلي‌مري‌ازگلوكز بوده، درحاليکه Mccp از مقادير مساوي گلوكز، گالاكتوز، مانوز، فوكوز، گالاكتوز آمين و گلوكز‌آمين تشکيل يافته است.

ليپيدها در غشا سيتوپلاسمي موليكيوتها به طور گسترده‌اي قرار گرفته‌اند، بطوري كه ٣٥-٢٥% وزن غشا آن را تشكيل مي‌دهند. Mmm داراي ليپوگليكاني است كه تا ١٠% وزن غشا را تشكيل مي‌دهد. ليپوگليكان‌هاي موليكيوتها محكم به غشا چسبيده اند، ولي در Mmm و ساير سويه‌هاي وابسته، در مقادير زياد در محيط كشت به صورت آزاد يافت مي شوند. احتمال دارد كه ساختار تب‌زاي Mmm از ليپوگليكان تشكيل يافته باشد.

تحقيقات نشان مي‌دهد كه از اين ساختار كپسول در تهيه واكسن موثر بر عليه MmmSC در موش استفاده مي‌شود. اين واكسن‌ها داراي كووالانت و تركيبات پلي‌ساكاريدي كپسول هستند كه به صورت كونژوگه و غير كونژوگه به كار رفته‌اند (۷۲).

هنگام رشد در محيط براث، اين رشته‌ها به صورت ماكروسكوپي قابل ديدن است و ممكن است نقشي در اتصال مايكوپلاسما داشته باشد.

در مطالعاتي كه بر روي مكانيسمهاي متابوليسم داخلي سلول MmmSC انجام شده است ،سيگنال‌هاي القا شده در مسير تشخيص به وسيله رسپتورها مورد بررسي قرار گرفته اند. نتايج نشان مي‌دهند كه بر خلاف ساير ارگانيسم‌ها، سيستم SRP RNA و دامنه M از Fft براي القا فعاليت GTPase در MmmSC ضروري نمي‌باشد (۷۱).

ساختمان مايكوپلاسما كاپري‌كولوم

ژنوم مايكوپلاسما كاپري‌كولوم حلقوي است كه اندازه‌اي در حدود kb٥/١١٥٥ دارد. ٢٥% محتواي ژنتيكي آن، از بازهاي G+C تشكيل شده است كه در مقايسه با ساير ميكروارگانيسم‌ها، بسيار اندك است. اين ميكروارگانيسم تنها داراي يك كروموزوم است. با وجود آن كه حضور پلاسميد در ساير گونه‌هاي مايكوپلاسما غير معمول است، در اين ميكروارگانيسم پلاسميدي به ابعاد kb٨/١-١/١ وجود دارد. به نظر ميرسد نقش اين DNA خارج كروموزومي، ايجاد مقاومت به آنتي‌بيوتيك‌ها است. چرا كه در گله‌هايي كه تحت درمان با آنتي‌بيوتيك‌ها بوده‌اند، اين پلاسميدغالبا يافت شده است (۳۲).

تحقيقات نشان مي‌دهد كه پلاسميد تكثير كننده Oric C در كاپري‌كولوم، حامل ژن dnaA و DnaA-box چسبيده به آن است و قابليت آن را دارد كه در ناقلين كلون كننده، تكثير شود. ژن dnaA داراي مناطقي از توالي‌هاي تكراري در باكتري‌هاي G+ با مقادير پايين G+C است. اين ژن به همراه دو ژن rpmH و dnaN در اين ميكروارگانيسم،از ساختمان بسيارحفاظت شده‌اي برخوردار است. حضور نامعمول تعداد زيادي اسيدآمينه (aa) جايگزين در DnaA كاپري‌كولوم، قابل توجه است. نواحي بالايي ژن dnaA، غير قابل ترجمه است و ساختاري حفاظت شده شبيه ساير باكتري‌هاي G+ و G- دارد.  يك منطقه غير قابل ترجمه ديگر در پايين ژن dnaA ديده مي‌شود كه تنها در باكتري‌هايG+ وجود دارد و نشان مي‌دهد كه اين باكتري، از اجداد باكتري‌هايG+ مشتق شده است. اين منطقه غني از آدنوزين و تيمين بوده و حاوي ١٠ توالي شبيه DnaA-box است. اين ناحيه در ساختار TTATCCACA مشترك است و تنها تفاوت آنها در يك يا دو نوکلوتيد مي باشد.

ساختمان سلولي مايكوپلاسما كاپري‌كولوم فاقد ديواره بوده و تنها يك غشا دو لايه‌اي دارد كه از كلسترول‌هاي غير استريفيه در غشا خارجي تشكيل شده است. در اين ميكروارگانيسم، فلاژلا يا پيلي وجود ندارد و براي رشد احتياجي به منبع خارجي كلسترول دارد. با اين وجود، اسيدهاي چرب جذب شده به مصرف متابوليسم و توليد انرژي نمي‌رسند، بلكه تنها در سنتز غشا فسفوليپيدي به كار مي‌روند. در ابتدا كلسترول جذب شده در تشكيل ساختارغشا خارجي شركت مي‌كند و سپس غشا داخلي را مي‌سازد. تحقيقات نشان مي‌دهد كه به كار رفتن اسيدهاي چرب در ساختمان غشا تحت تاثير غلظت گلوكز و گليسرول، دما و pH خارجي است. زماني كه كاپري‌كولوم در محيط‌هايي با غلظت‌هاي متفاوت استرول، قرار مي‌گيرد، سرعت رشد آن تغيير مي‌كند و ممكن است تركيبات ليپيدي غشا به ٦٠% فسفاتيديل گليسرول و ٣٥% کارديوليپن برسد (۷۴).

ساختمان tRNA اين ميكروارگانيسم به گونه‌اي تكامل يافته است كه قادر به سنتز پروتئين از اسيدهاي آمينه آلي مي‌باشد. تحقيقي كه از آن به عنوان Amber supression نام برده مي‌شود، مشخص نموده است كه ساختار تكاملي ژن tRNA در Mcc، از نياكان Bacillus subtilis مشتق شده است و مجموعاً ۳۰‌ژن كد كننده ٢٩ tRNA در اين گونه وجود دارد. اين ميزان ژن، جزوحداقل سيستم‌هاي ژنتيكي  شناخته شده در پرو‌كاريوت‌ها به جز ميتوكندري‌ها است. با اين وجود، افزوده شدن و حذف تعدادي از توالي‌هاي تكراري موجب شده است كه تمامي كدون‌ها به تعداد محدودي از tRNA ترجمه شوند. اختصاصي بودن اين ساختار در كل مايكوپلاسما، مي‌تواند اساس شناخت اين ميكروارگانيسم قرار بگيرد (۴۲).

كپسول پلي‌ساكاريدي گالاكتان ،به عنوان القا كننده توكسين احتمالي اين ميكروارگانيسم محسوب مي‌شود. به هر حال واكنش دستگاه ايمني در مواجهه با ساختار ليپوپروتئيني غشاي‌ اين كپسول منجر به افزايش ۶IL، NFα، واكسيدنيتريك در ماكروفاژها مي‌شود كه اين تركيبات به همراه اكسيژن‌ راديكالهاي آزاد، تركيب بسيار سمي پراكسي‌نيتريت توليد مي‌كنند. اين تركيب و آنزيم‌هاي هيدروليتيك كه به وسيله اين ميکروارگانيسم توليد مي‌شوند، عامل اصلي نكروز و زخم‌هاي هپاتيزه شده ريه در عفونت پلوروپنوموني عنوان مي‌شوند.

بيولوژي ملكولي

از اشكالات مطالعه ژنوم مايكوپلاسما، بيان محدود ژن‌هاي كلون شده مايكوپلاسما در باكتري ميزبان است. چون در مايكوپلاسما،رمز UGA به عنوان يك كدون تريپتوفان ترجمه مي‌شود، در حاليکه در سايرين به عنوان كد خاتمه دهنده شناخته مي‌شود. از اين رو، سنتز پروتئين در هنگام مواجهه با اين كدون ناقص مي‌شود. ظرفيت محدود مايکوپلاسما براي سنتز نوكلئوتيدها با توانايي آن در استفاده از اسيدهاي نوكلئيك در محيط كشت، جبران مي‌شود و مي‌تواند در تنظيمات داخل سلولي و تبديل اسيدآمينه پورين به پيرميدين شركت كند (۴۴).

نسخه‌برداري از DNA، مكانيسم‌هاي تعمير، ساز و كارهاي محدودسازي و تعديل كردن، وجود جايگاه اضافه كردن جهت كاربرد در ترانسپوزون و تغيير شكل وابسته به پلاسميد، همگي اشاره به ژنوم تكامل يافته مايكوپلاسما دارد. به هر حال، تفاوت‌هاي اساسي در محتواي ژنتيكي بازهاي نوكلئوتيدي G+C، كاربرد كدون‌ها، و ساختار و عملكرد آنزيم‌هاي تصحيح كننده توالي‌ها با ساير باكتري‌ها ديده مي‌شود (۵۰).

به خصوص، آناليز DNA پلي‌مراز مايكوپلاسما حاكي از عدم فعاليت اگزونوكلئاز ۳′-۵′ در ميكروارگانيسم را دارد. اين آنزيم در ساير باكتري‌ها عملكرد تصحيح خواندن را به عهده دارد. در نتيجه، ممكن است توالي‌ رشته‌هاي DNA در مايكوپلاسمامکمل صحيحي نباشد (۷۱).

اين امر باعث مي‌شود كه موتاسيون در ژنوم با سرعت بالا اتفاق بيافتد. موتاسيون فراوان در دامنه وسيعي درهمه اعضا كلاستر مايكوئيدس ديده مي‌شود. به علت  نقص  درتكنيك‌هاي پيچيده ملكولي، بسياري از تلاش‌ها براي اندازه‌گيري دقيق ژنوم سويه‌هاي MmmSC موفق نبوده است (۶۸).

از اين رو سايز ژنوم سويه PG1،  kbP760، kbP 810 يادرحدود  kbP 923 تخمين زده مي‌شود. به هر حال، با استفاده از روش‌هاي پيشرفته (PFGE)، ميزان ژنوم اين سويه در حدود kbP 1280 محاسبه شده است. مقايسه نقشه ژنومي ٤ سويه MmmSC ،تفاوت‌هاي اندكي را در اندازه و فواصل بين جايگاه‌هاي اثر آنزيمهاي محدود کننده نشان مي‌دهد. تمامي جايگاه‌هاي محدود شده،  به طرز محسوسي حفاظت شده هستند. تحقيقات نشان مي دهد كه DNA مايكوپلاسما MmmLC (سويه Y) نسبت به هضم آنزيم MboI مقاوم است. اين آنزيم در محل اثر خود(GATC) ، به وسيله متيلاسيون آدنين غير فعال مي‌شود. اما آنزيم DPnI مي‌تواند درهمان جايگاه اثر كند که براي فعاليت خود، احتياج به متيلاسيون آدنين دارد (۷۴).

ساير اعضا كلاستر مايكوئيدس مورد بررسي قرار گرفته اندو مشخص شده كه تمامي سويه‌هاي MmmSC و bsg7، و برخي سويه‌هاي Mmc و Mcc فاقد متيلاسيون آدنين در اين جايگاه هستند، در حالي كه تمامي سويه‌هاي MmmLC و Mccp در محل شكافت GATC، متيله شده‌اند.در تحقيقات ، از اين خاصيت  براي شناسايي اعضا كلاستر استفاده مي‌شود (۷۱).

مطالعات هيبريداسيون ساترن بلات نشان داده است كه پروب ژن CAP21، با استفاده از هضم آنزيم‌هاي محدودالاثر بر روي گونه Mmc، تفاوت‌هاي آشكاري  را بين تيپ‌هاي SC و LC مشخص مي‌كند. اگر چه باهمين روش بين دو گونه LC و Mmc شباهتهاي بسياري هويدا ميشود كه امروزه جزو يك گونه طبقه‌بندي ميگردند (۴۷) .

مقايسه‌اي بين توالي نوكلئوتيدهاي اعضا كلاستر مايكوئيدس ثابت كرده است كه  گونهbsg7 شباهت كمتري به اعضا اين كلاستر دارد واز نظر فيلوژني، نزديك‌ترين گونه به آن MmmSC مي‌باشد (۴۷).

هم‌چنين اين مطالعات نشان داد كه سويه‌هاي آفريقايي با اروپايي منشا كاملاً متفاوتي دارند و هتروژنوسيتي ميان سويه‌هاي آ‏فريقايي بيشتر از سويه‌هاي اروپايي است (۶۸).

علاوه بر اين، در جدايه‌هاي MmmLC، که قبلاً تصور ميشد هموژن هستند، هتروژنوسيتي فراوان ناشي از پلي‌مورفيسم به چشم مي‌خورد (۷۰).

پروب CAP21 قادر به تفكيك گونه Mcc از Mccp نمي‌باشد و تفكيك اين دو گونه تنها با استفاده از پروب  ۱۶S-rRNA كه در مطالعات بعدي مطرح شده است، امكان‌پذير است (۷۳).

ژنوم مايكوپلاسما كه از نظر محتواي ژنتيكي G+C پايين است، از نظر غلظت بازهاي آدنين و تيمين در سومين جايگاه كدون‌ها غني مي‌باشد (۵۰). در MmmSC، ٤/٩١% مول از نوكلئوتيدها، از بازهاي A+T تشکيل يافته‌اند،و تنها ۱۰كدون CGG يافت مي‌شود. اين يافته با اين فرضيه كه MmmSC تنها داراي يك tRNA منفرد جهت كد كردن كدون CGN است (که به جاي N مي‌تواند A، C، G يا T باشد)، همخواني دارد. در حالي كه ساير موليكيوتهاي تعيين توالي شده داراي ٢ tRNA براي اين منظور هستند که اين امر ميتواند در شناسايي اين گونه ابزار موثري باشد (۴۲).

مطالعات نشان داده است كه ترجمه ژن‌هاي سنتز شده در كاپري‌كولوم که تا ٩٩% شباهت ژنتيكي بين ژن۱۶S-rRNA  دو گونه وجود دارد، با رسيدن به كدون CGG خاتمه پيدا مي‌كند و اين كدون در كاپري‌كولوم ترجمه نمي‌شود.

حضور ژن منفرد tRNA (NCG) و مشاهده اتفاقي كدون CGG در ژنوم MmmSC، به اين نكته اشاره دارد كه اين كدون نيز مانند كاپري كولوم، يك كدون خاتمه دهنده تلقي مي‌شود (۴۲).

كدون UGA در اكثر موليكيوتها به عنوان تريپتوفان ترجمه مي‌شود، اما اين كدون در MmmSC ٢٤مرتبه تکرار شده است كه مشابه كدون UGG است. تنهاتوضيحي كه در اين رابطه مي‌توان ابراز كرد اين است كه مقادير فراوان كدون UGA موجب فشار انتخابي منفي و كاهش محتواي ژنتيكي C+C مي گردند (۷۱).

۹- توالي‌هاي تكراري

مقايسه بين ژنومي MmmSC با سايرين نشان مي‌دهد كه ژنوم اين ميكروارگانيسم داراي تعداد فراواني از توالي‌هاي پشت سر هم تكراري است كه در حدود ٢٩% كل ژنوم را تشكيل داده‌اند. سايز بيشترين تكرارها kb٢٤، ١٣ و ١٢ مي‌باشد. محل قرارگيري اين تكرارها در IS element است كه موجب تغييرات بازآرايي مي‌شود و سپس  تكثير مي‌يابند.

ژن‌هاي مشابه‌اي كه در اين منطقه قرار گرفته‌اند، تحت اثر فشار منفي انتخابي در پروسه تكامل، فشرده شده و به يك يا دو ژن مضاعف شده تقليل مي‌يابند (۵۰).

بيشتر از ١٣% ژنوم SC از سه نوع IS element تشكيل يافته است، از اين رو اين ميكروارگانيسم داراي بيشترين غلظت IS اي هست كه تا كنون تعيين توالي شده است. IS Mmy1، با طول bp١٦٧٠، در ٨ نسخه كامل و يك نسخه فشرده شده، نمود يافته است.

IS Mmy1 در مايكوپلاسما بويس نيز يافت شده است، در حالي كه مايكوپلاسماهايي كه از نظر فيلوژني به MmmSC نزديك‌ترند، فاقد اين ساختار هستند.

تحقيقات ساترن‌بلات نشان داده است كه الگوي منحصر به فردي از هيبريداسيون سويه‌هاي MmmSC و سويه واكسن T1Sr49 با استفاده از پروب IS Mmy1 به دست آمده است. اين نشان مي‌دهد كه IS Mmy1 مي‌تواند به عنوان ماركر تشخيص جهت جداسازي سويه‌هاي واكسن از سويه‌هاي فيلد به كار رود. دو IS element ديگر، ۱۶۳۴ IS و ۱۲۹۶ IS  سبا طول bp ١٨٧٢ و ١٤٨٥ هستند كه در ٦٠ نسخه وجود دارند. به نظر مي‌رسد كه IS element‌هادر تمام طول ژنوم توزيع شده‌اند و تنها در سه منطقه وجود ندارندکه هنوز توضيح مشخصي براي عدم حضور آن‌ها در اين مناطق وجود ندارد، به غير از اين كه آن‌ها تنهادر مناطق بسيار حفاظت شده در موليكيوتها نظير اپرون‌هاي پروتئين‌هاي ريبوزومي، ژن‌هاي سنتز ATP و ژن پيرووات دي‌هيدروژناز جاي ميگيرند (۷۰).

توالي ژنوم MmmSC جهت مطالعات تهيه واكسن، بررسي اثربخشي داروها و روش‌هاي تشخيص آزمايشگاهي به طور كامل بررسي شده است.

اين ميكروارگانيسم اولين ژنوم مطالعه شده از گروه اسپيروپلاسماها است كه به طور كامل تعيين توالي گرديده و درجات تكاملي آن در گروه موليكيوتها مورد تحقيق است (۷۱).

اندازه ژنوم سويه PG1T، درحدود bp  ۲١١۷۰۳ است كه از يك كروموزوم حلقوي تشكيل يافته است. كمترين تعداد گزارش شده از محتواي G+C (mol٢٤%) از اين ميكروارگانيسم بوده كه داراي بيشترين تعداد توالي‌هاي اضافه شده (Insertion) درژنوم مي‌باشد كه در حدود ١٣% سايز ژنوم را تشكيل داده‌اند. ژنوم MmmSC متشكل از ٩٨٥ ژن مي‌باشد كه ٧٢ تاي آن از ژن‌هاييست كه داراي توالي‌هاي اضافه شده هستند و نقش كد كننده ترانسپوزها را دارا ميباشند. وجود الگوهاي نامنظم در محتواي ژنتيكي GC و مقادير زيادي از توالي‌هاي تكرار شونده بيان‌گر انعطاف‌پذيري بالاي ژنوم در وقوع جهش است (۵۴).

تعداد ژن‌هايي كه مسئول فعاليت‌هاي مختلف در MmmSC هستند، تقريباً شبيه ساير موليكيوتهاي تعيين توالي شده است. تا كنون توالي چندين موليكيوت مشخص شده اند:

١) مايكوپلاسما جنيتاليوم (١٩٩٥)٬  ٢) مايكوپلاسما پنوموني (١٩٩٦)٬
٣) مايكوپلاسما پلوروم (٢٠٠٢)٬ ٤) مايكوپلاسما پنترانس (٢٠٠٢)همگي اين مايكوپلاسما به گروه پنوموني تعلق دارند، ٥) مايكوپلاسما پولمونيس (٢٠٠١) كه اين مايكوپلاسما در طبقه‌بندي گروه هومي‌نيس قرار مي‌گيرد (۷۱).

MmmSC كه جزو گروه اسپيروپلاسما است با ساير موليكيوتهاي تعيين توالي شده تفاوت‌هايي دارد، اگر چه ٨٠-٧٥% تشابه ژنتيكي با آنها بر اساس ۱۶S-rRNA گزارش شده است.

مقايسه سيستم انتقالي پروتئيني گسترده در MmmSC در مقايسه با ساير گونه‌هاي پولمونيس حاکي از آن است كه اين گونه تطابق بيشتري براي بقا در بافت‌هاي متنوع دارد ومحل کلونيزاسيون آن مي‌تواند به عفونت سيستميك تبديل شود.

تعداد زيادي ژن ترانسپوزشده در IS element جاي گرفته‌اند كه در طبقه‌بندي مجزايي قرار مي‌گيرند (۷۱).

پروتئين‌هاي سطحي

گونه‌هاي مايكوپلاسما قادرند كه تركيبات پروتئين‌هاي سطحي خود را تغيير دهند كه در واقع به اين عمل، تنوع آنتي‌ژنتيكي اطلاق مي‌شود. اين امر براي افزايش كلونيزاسيون و اتصال به بافت ميزبان در مراحل مختلف عفونت اتفاق مي‌افتد. تنها ژني كه مسئول وارياسيون آنتي‌ژنتيكي در MmmSC مي‌باشد، Vmm ناميده مي‌شود كه پيش‌سازهاي ليپوپروتئيني را با فازهاي متغير كد مي‌كند. بيان ژن Vmm مي‌تواند به صورت روشن يا خاموش (فعال يا غير فعال شدن) يک ژن باشد كه از طريق تغيير تعداد تكرارهاي TA در پروموتور اسپيسر ژن Vmm در يك جمعيت از كلوني‌هاي MmmSC اتفاق بيافتد (۱).

مكانيسم ملكولي كه منجر به هايپرموتاسيون در پروموتور اسپيسر مي‌شود، هنوز ناشناخته است، اما احتمال مي‌رود اين امر ناشي از تغيير در تعداد تكرارها در زمان نسخه‌برداري باشد كه قطعه قطعه شدن به وسيله آنزيم پلي‌مراز آن را ايجاد كرده باشد. جالب توجه اين است كه توالي ژنومي، حاكي از حضور ٥ ژن اضافي كد كننده ليپوپروتئين است كه پروموتورهايي با ٥ تا ١٢ تكرار TA، در اولين قطعه چهار نوكلئوتيدي از ١٠ قطعه آن را کد مي‌کنند. توالي DNAهاي نوتركيب نشان مي‌دهد كه جمعيت‌هايي با تعداد متغير از تكرارهاي TA در پروموتور MSC-0117 و MSC-1005 وجود دارد. هنگامي كه اضافه شدن و يا حذف دي‌نوكلئوتيدها در جمعيت كلون شده SC اتفاق مي‌افتد، موتاسيون جديدي بوجود ميايد.

علاوه بر اين، مناطقي از نوكلئوتيدهاي شبيه بهم كه شامل ١٥ تا ٢٣ آدنين هستند، در پروموتور ٩ ژن از پروتئين‌هاي سطحي ديده مي‌شود. ممكن است اين توالي‌هاي تكراري در تنظيم نسخه‌برداري نقش داشته باشند. هم چنين، دو ژن در پروتئين‌هاي سطحي وجود دارند كه مونونوكلئوتيدهايي مشتمل بر ١٠ تا ١٤ تيمين هستند. اين توالي‌هاي تكراري موجب تغييرات اندازه‌اي در پروتئينها مي‌شوند و به وسيله تنظيمات چارچوبي (frame)تعديل مي‌شوند.

عدم صحيح جفت شدن باندها، موجب قرائت‌هاي نادرست از تعداد تكرارها مي‌شود كه اين امر اختلال در چارچوب تصحيح كننده[۵] را بوجودمي آورد. علاوه بر اين‌، ٣٤ ژن ليپوپروتئيني و١٤٤ ژن پروتئين بين غشايي وجود دارد كه هنوز عمل شناخته شده‌اي ندارند، اما در محصولات پروتئيني آن‌ها، فاكتور ويريولانس ديده ميشود كه، ممكن است نقش اين پروتئين‌ها را در اتصال و تداخل عمل با ميزبان رقم بزند (۲۵).

٧ عدد از IS MmyI elementها درون پروموتور افزوده شده‌اند كه تكرارهايي از TA دارند و گاه موجب از بين رفتن بيان پروتئين‌هاي فاز متغير مي‌شوند. ٣ قطعه از پروموتورها در قسمت پاياني ژن‌هاي كد كننده غشا پروتئيني قرار گرفته اند. چهارمين قطعه فاقد ژن ارتباط دهنده مي‌باشد و احتمالاً از ژنوم حذف شده است (۱).

ليپوپروتئين‌هاي سطحي که مسئول تغييرات آنتي‌ژنتيكي هستند، با دامنه تكراري پشت سر هم شناسايي مي‌شوند. اين ملكول‌ها با اتصال به ليگاند، در تغييرات آنتي‌ژنتيكي و تداخل عمل بين پاتوژن و ميزبان نقش دارند. تكرارهاي پشت سر هم و ژن كدكننده آنتي‌ژن‌ در آن‌ها به گونه‌اي است كه امكان موتاسيون فراوان را با كم و زياد كردن اين تكرارها فراهم مي‌كنند. در نتيجه تغيير در تعداد تكرارهاي پشت سر هم در انتهاي كربوكسيل، محصولات متنوع پروتئيني به وجود مي‌آيند كه مي‌توانند اساس شناسايي هر گونه قرار بگيرند. فراواني اين ليپوپروتئين‌هاي سطحي در غشا مايكوپلاسما بسيار قابل توجه است. به طوري كه  غشا از اين ليپوپروتئين‌ها تشكيل يافته است كه اغلب دترمينانت آنتي‌ژنتيكي و ايمونوژن هستند (۱).

در غشا خارجي مايكوپلاسماي پاتوژن، تعداد زيادي از اسيدآمينه پرولين قرار گرفته است كه چين‌خوردگي پروتئين و ساختار اصلي ناحيه اتصالي ليپوپروتئين را تشكيل داده است. اين بخش از غشا در اتصال و روند بيماري‌زايي نقش مهمي دارد. در حقيقت، همين پروتئين‌هاي اتصالي، نقش آنتي‌ژنتيكي هم دارند. تفاوت بين جدايه‌ها، از نظر خواص اتصال و بيماري‌زايي، از تفاوت در ناحيه كربوكسيل اين ليپوپروتئين‌ها مشتق مي‌شود (۷۱).

شناسايي اين ليپوپروتئين‌ها در غشا مايكوپلاسماي پاتوژن نشخواركنندگان، هنوز در دست تحقيق است. در گونه MmmSC، سه ليپوپروتئين مهم (LPPA) A، (LPPB) B و (LPPQ) Q شناسايي شده‌اند. نقش LPPA به عنوان ليپوپروتئين مشترك در همه اعضا كلاستر مورد توجه است. اين ليپوپروتئين در MmmSC، اپي‌توپ مخصوص به خود را دارد كه در ساير اعضا ديده نمي‌شود و در شناسايي اختصاصي اين گونه ابزار موثري است (۱).

محل ژنوميكي ليپوپروتئين A در كلاستر مايكوئيدس نزديك به جايگاه ژن‌هاي mltD (مانيتول فسفات دي‌هيدروژناز) است كه ساختمان بسيار حفاظت شده‌اي   دارد. در گونه Mcc توليد اين ليپوپروتئين به وسيله ژن Mcaca، تنظيم مي‌شود كه پروتئيني به وزن ملكولي KDa ٥/٥٧ است. اين محصول پروتئيني از ليپوپروتئين A، اختصاصي اين گونه است و در ساير اعضا كلاستر ديده نمي‌شود. آناليز توالي اين ليپوپروتئين حاكي از ٧١-٦٥% قرابت با ساير اعضا كلاستر است كه تنها در ٤ اسيدآمينه (جايگاه ٣، ٤، ٩ و ٢٢) با LPPA از گونه MmmSC و۷ bsg تفاوت دارد. اما آنتي‌بادي‌هاي پلي‌كلونال موش كه بر عليه Mcaca نوتركيب ايمن شده باشند، تنها با گونه Mcc واكنش مي‌دهند، به همين علت، آنتي‌بادي Mcaca مي‌تواند به طور اختصاصي زيرگونه Mcc را شناسايي كند. در گونه Mccp، ژن كاذبي در محل كد كردن اين ليپوپروتئين قرار گرفته است كه از نظر اندازه مشابه ژن فعال LPPA در ساير اعضا است. اين امر نشان مي‌دهد كه تمامي اعضا كلاستر داراي يك گونه، تحت گونه و تايپ خاصي از آنالوگ LPPA هستند كه قبلاً در MmmSC، P27 ناميده مي‌شد. به كار بردن پرايمرهاي اختصاصي مي‌تواند ژن LPPA را در گونه Mcc تكثير كند كه با به كار بردن اين پرايمر، از ساير مايكوپلاسماها شناسايي ميشود (۴۱).

ليپوپروتئين Q ايمنوژن ٤٨ كيلودالتوني است كه در واقع عامل اصلي بيماري‌زايي CBPP محسوب مي‌شود. اين ژن از تايپينگ سويه‌هاي متفاوت در استراليا، اروپا و ساير سويه‌هاي واكسن به دست آمده است و به عنوان آغازگر فعاليت آنزيم پپتيداز III در پروكاريوت‌ها شناخته مي‌شود. آناليز توالي ژن نشان مي‌دهد كه ساختمان غشا مارپيچي آن به سمت داخل تمايل يافته  و دامنه انتهاي كربوكسيلي آن، در سطح خارجي اين ليپوپروتئين قرار گرفته است. اين منطقه در بروز پاسخ‌هاي ايمني زود هنگام، اختصاصي و سريع در مبتلايان به CBPP نقش دارد كه مقاديرآن حتي تا  مدت ها پس از بروز ترشح ساير ايمونوگلوبين‌ها، پايدار مي‌ماند. دامنه انتهايي كربوكسيلي اين ليپوپروتئين تحت اثر موتان‌هاي مستقيم از ٩ كدون اختصاصي مايكوپلاسما( TGA) به TTG تبديل شده است. كدون TGA كه در مايكوپلاسما به تريپتوفان ترجمه مي‌شود، با كلون شدن در E.coli به صورت كدون خاتمه شناسايي مي‌شود (۱).

وجود اين موتاسيون ژني، اساس شناسايي مبتلايان در آزمونهاي سرولوژي مي‌باشد كه براي توليد پروتئين‌هاي نوتركيب از اين جهش در ناقل كلون كننده، به صورت LPPQm شناسايي مي‌شود (۱).

ليپوپروتئين B تنها در سويه آ‏فريقايي MmmSC ديده شده و در سويه‌هاي اروپايي وجود ندارد. در واقع تغييرات آنتي‌ژنتيكي مايكوپلاسماها ناشي از تغيير در اين ليپوپروتئين‌ها است كه با بيان يا عدم بيان يك ژن مشخص مي‌شودو به صورت جهش‌هايي در واريته‌هاي جديد خود را نشان مي‌دهد.

فهرست مطالب

الف- مقدمه                                                                                                                              ۱

ب-چکيده                                                                                                                                ۳

فصل اول:کليات …………………………………………………………………………………………………………………………………………. ۵

۱- تاريخچه    ……………………………………………………………………………………………………………………………………………. ۶

۲- خصوصيات کلي مايکوپلاسما…………………………………………………………………………………………………………….. ۶

۳- مقاومت مايکوپلاسماها………………………………………………………………………………………………………………………. ۸

۴- طبقه بندي مايکوپلاسماها…………………………………………………………………………………………………………………. ۹

۵- طبقه بندي کلاستر مايکوئيدس………………………………………………………………………………………………………… ۱۲

۶- فيلوژني   ……………………………………………………………………………………………………………………………………………. ۱۴

۷- ساختمان  …………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۵

۱-۷-ساختمان مايکوپلاسما مايکوئيدس …………………………………………………………………………………………………… ۱۵

۲-۷- ساختمان مايکوپلاسما کاپري کولوم …………………………………………………………………………………………… ۱۷

۸- بيولوژي مولکولي……………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۹

۹- توالي‌هاي تکراري……………………………………………………………………………………………………………………………….. ۲۳

۱۰- پروتئينهاي سطحي………………………………………………………………………………………………………………………….. ۲۵

۱۱- فاکتور حدت………………………………………………………………………………………………………………………………………. ۳۰

۱۲- آناليز پروتئين  ………………………………………………………………………………………………………………………………. ۳۲

۱۳- طبقه بندي سويه‌ها ………………………………………………………………………………………………………………………… ۳۴

۱۴- مشخصات گونه مايکوئيدس…………………………………………………………………………………………………………… ۳۵

۱۵- کشت و رشد گونه مايکوئيدس ……………………………………………………………………………………………………… ۳۸

۱۶- کشت و رشد گونه کاپري کولوم …………………………………………………………………………………………………… ۴۱

۱-۱۶- محيط Thiacourt  ……………………………………………………………………………………………………………………. ۴۱

۱۷- بيماري پلوروپنوموني واگير گاوان……………………………………………………………………………………………….. ۴۴

۱-۱۷- علائم باليني ……………………………………………………………………………………………………………………………….. ۴۵

۲-۱۷- علائم کالبدگشايي بيماري …………………………………………………………………………………………………………. ۴۷

۳-۱۷- پاتوژنز ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. ۵۰

۱-۳-۱۷- مکانيسمهاي مقابله با دستگاه ايمني…………………………………………………………………………………….. ۵۳

۴-۱۷- اختصاصيت ميزبان…………………………………………………………………………………………………………………….. ۵۷

۵-۱۷- انتقال بيماري  …………………………………………………………………………………………………………………………….. ۵۸

۶-۱۷- سير همه گيري ……………………………………………………………………………………………………………………………… ۵۹

۱-۶-۱۷- مخزن………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۵۹

۲-۶-۱۷- راه انتقال………………………………………………………………………………………………………………………………….. ۵۹

۷-۱۷- پيشگيري و کنترل………………………………………………………………………………………………………………………. ۶۰

۱-۷-۱۷- اقدامات لازم براي حفاظت مناطق عاري از بيماري…………………………………………………………………. ۶۱

۲-۷-۱۷- اقدامات لازم هنگام شيوع بيماري…………………………………………………………………………………………… ۶۲

۳-۷-۱۷- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومي……………………………………………………………………………………….. ۶۳

۱۸- بيماري پلوروپنوموني واگير بزان ……………………………………………………………………………………………….. ۶۳

۱-۱۸- علائم باليني ……………………………………………………………………………………………………………………………….. ۶۴

۲-۱۸- علائم کالبد گشايي………………………………………………………………………………………………………………………. ۶۶

۱۹- گونه مايکوپلاسما کاپريکولوم کاپريکولوم…………………………………………………………………………………… ۶۹

۱-۱۹- سندروم MASKePs…………………………………………………………………………………………………………………. 70

۲-۱۹- علائم باليني…………………………………………………………………………………………………………………………………. ۷۱

۳-۱۹- علائم کالبد گشايي………………………………………………………………………………………………………………………. ۷۱

۴-۱۹- سندروم آگالاکتيه واگير……………………………………………………………………………………………………………… ۷۳

۲۰- گونه مايکوپلاسما کاپري ……………………………………………………………………………………………………………….. ۷۳

۱-۲۰- بيماريزايي ………………………………………………………………………………………………………………………………….. ۷۳

۲-۲۰- علائم کالبد گشايي………………………………………………………………………………………………………………………. ۷۴

۲۱- سير همه‌گيري……………………………………………………………………………………………………………………………….  ۷۵

۱-۲۱-مخزن  …………………………………………………………………………………………………………………………………………  ۷۵

۲-۲۱-راه انتقال…………………………………………………………………………………………………………………………………….       ۷۶

۳-۲۱-جمعيت ميزبان……………………………………………………………………………………………………………………………  ۷۷

۲۲-پيشگيري وکنترل ………………………………………………………………………………………………………………………….        ۷۷

۱-۲۲- اقدامات لازم براي محافظت مناطق عاري از بيماري………………………………………………………………..       ۷۷

۲-۲۲- اقدامات لازم هنگام شيوع بيماري…………………………………………………………………………………………….  ۷۸

۳-۲۲- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومي…………………………………………………………………………………………  ۷۸

۲۳-واکسن    …………………………………………………………………………………………………………………………………………  ۷۹

۱-۲۳-واکسن MmmLC ……………………………………………………………………………………………………………………        ۷۹

۲-۲۳-واکسن Mccp …………………………………………………………………………………………………………………………..   ۷۹

۳-۲۳-واکسن Mcc ………………………………………………….. 79 79-اختصاصيت ميزبان در کلاستر مايکوئيدس………………………………………………………………………………………………………….        ۸۰

۲۵-تشخيص افتراقي……………………………………………………………………………………………………………………………. ۸۰

۱-۲۵-شناسايي عامل بيماري زا ……………………………………………………………………………………………………….. ……..             ۸۱

۱-۱-۲۵-بررسي ميکروسکوپيک اگزوداي ريه از طريق تهيه اسمير يا برش بافتي……………………….. ۸۱

۲-۲۵- تشخيص آزمايشگاهي …………………………………………………………………………………………………………….  ۸۱

۱-۲-۲۵- روش کشت و جداسازي………………………………………………………………………………………………………. ۸۱

۱-۱-۲-۲۵- انتخاب نمونه ها ……………………………………………………………………………………………………………………..  ۸۲

۲-۱-۲-۲۵- آماده سازي نمونه ها …………………………………………………………………………………………………….        ۸۲

۳-۲۵- تستهاي بيوشيمي……………………………………………………………………………………………………………………. ۸۳

۴-۲۵- روشهاي سرولوژي………………………………………………………………………………………………………………….. ۸۵

۱-۴-۲۵- عوامل موثر در آزمايشات سرولوژي …………………………………………………………………………………………             ۸۵

۲-۴-۲۵- تست مهاري رشد  ……………………………………………………………………………………………………………………….  ۸۷

۳-۴-۲۵- تست ايمونو فلورسانس …………………………………………………………………………………………………………….  ۸۸

۴-۴-۲۵- تست رسوب ژلي…………………………………………………………………………………………………………………. …….. ۸۸

۵-۴-۲۵- تست فيکساسيون کامپلمان ………………………………………………………………………………………………………..  ۸۹

۶-۴-۲۵- تست ممانعت از هماگلوتيناسيون ……………………………………………………………………………………………..  ۸۹

۷-۴-۲۵- تست آگلوتيناسيون لاتکس……………………………………………………………………………………………….. ۹۰

۸-۴-۲۵- تست اليزاي رقابتي……………………………………………………………………………………………………………… ۹۱

۹-۴-۲۵- ساير تستهاي تشخيصي…………………………………………………………………………………………………….. ۹۴

۵-۲۵ – مشکلات روشهاي سنتي…………………………………………………………………………………………………………. ۹۴

۶-۲۵- تشخيص با استفاده از PCR…………………………………………………………………………………………………. 95

فصل دوم: روش کار

۲۶- روش کار ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۰۱

۱-۲۶- جمع آوري نمونه …………………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۰۱

۱-۱-۲۶- مواد لازم……………………………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۰۱

۲-۱-۲۶- بخش جمع آوري نمونه………………………………………………………………………………………………………. ۱۰۱

۳-۱-۲۶- نمونه برداري ……………………………………………………………………………………………………………………… ۱۰۳

۲-۲۶- کشت و جداسازي نمونه ها……………………………………………………………………………………………………… ۱۰۴

۱-۲-۲۶- مواد لازم ……………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۰۴

۲-۲-۲۶- طرز تهيه محيط کشت اختصاصي براي جداسازي مايکوپلاسماي نشخوار کنندگان ……………. ۱۰۶

۱-۲-۲-۲۶- مواد لازم …………………………………………………………………………………………………………………………. ۱۰۶

۲-۲-۲-۲۶- روش تهيه محيط کشت…………………………………………………………………………………………………………… ۱۰۷

۳-۲۶- استخراج DNA مايکوپلاسما………………………………………………………………………………………………….. ۱۰۹

۱-۳-۲۶- روش استخراج DNA از نمونه هاي ارسالي…………………………………………………………………………….. ۱۰۹

۴-۲۶- فرايند PCR ……………………………………………………………………………………………………………………………. 110

۱-۴-۲۶- مواد لازم ……………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۱۰

۲-۴-۲۶- آماده سازي مواد جهت واکنش PCR ……………………………………………………………………………………….. 112

۱-۲-۴-۲۶- افزوده سازي DNA نمونه‌ها ……………………………………………………………………………………….. ۱۱۲

۲-۲-۴-۲۶- افزوده سازي DNA کلونيهاي جدا شده………………………………………………………………………. ۱۱۵

۳-۲-۴-۲۶- تهيه مخلوط اصلي اوليه………………………………………………………………………………………………… ۱۱۵

۳-۴-۲۶- پرايمرها……………………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۱۵

۴-۲۶- واکنش PCR…………………………………………………………………………………………………………………………… 117

۵-۲۶- تهيه ژل الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………… ۱۱۸

۱-۵-۲۶- طرز تهيه محلول اتيديوم برمايد ……………………………………………………………………………………………….. ۱۱۹

۶-۲۶- الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………………………………. ۱۲۱

۷-۲۶- رويت باندهاي ايجاد شده ………………………………………………………………………………………………………. ۱۲۲

فصل سوم: نتايج

۲۷- نتايج    ………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۲۴

۱-۲۷- جداسازي…………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۲۴

۱-۱-۲۷- بررسي عملکرد محيط کشت………………………………………………………………………………………………. ۱۲۴

۲-۱-۲۷- نتايج کشت نمونه هاي ارسالي ………………………………………………………………………………………… ۱۲۴

۱-۲-۱-۲۷- نتايج روز پنجم  ……………………………………………………………………………………………………………. ۱۲۵

۲-۲-۱-۲۷- نتايج روزهفتم تا دهم…………………………………………………………………………………………………….. ۱۲۵

۳-۲-۱-۲۷- نتايج روزپانزدهم…………………………………………………………………………………………………………… ۱۲۶

۲-۲۷- نتايج  PCR  ………………………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۲۶

۱-۲-۲۷- نتايج  PCR نمونه ها با پرايمر جنس ……………………………………………………………………………. ۱۲۶

۲-۲-۲۷- تائيد کلوني هاي جدا شده………………………………………………………………………………………………….. ۱۲۷

۳-۲-۲۷- نتايج  PCR نمونه ها با پرايمر کلاستر مايکوئيدس……………………………………………………… ۱۲۷

۴-۲-۲۷- نتايج  PCR نمونه ها با پرايمر گونه آگالاکتيه………………………………………………………………. ۱۲۸

۵-۲-۲۷- نتايج  PCR نمونه ها با پرايمر گونه مايکوئيدس کلوني بزرگ…………………………………… …….. ۱۲۹

۳-۲۷- نتايج کالبد گشايي………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۳۰

۱-۳-۲۷- معيار انتخاب ………………………………………………………………………………………………………………………. ۱۳۰

فصل چهارم: بررسي نتايج

نمودارها       ………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۳۱

فصل پنجم: بحث

۲۸- بحث      ………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۳۹

۱-۲۸- ضايعات کالبد گشايي……………………………………………………………………………………………………………………… ۱۳۹

۲-۲۸- ميزان وقوع عفونت تنفسي مايکوپلاسما ………………………………………………………………………………. ۱۴۱

۳-۲۸- روش کشت……………………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۴۲

۴-۲۸- روش  PCR  ………………………………………………………………………………………………………………………….. ۱۴۷

۵-۲۸- فراواني گونه ها ………………………………………………………………………………………………………………………. ۱۵۲

۲۹- خلاصه انگليسي…………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۵۹

۳۰- منابع    ………………………………………………………………………………………………………………………………………… ۱۶۰

فهرست تصاوير

تصوير شماره ۱: کلوني تخم مرغي شکل مايکوپلاسما پس از سومين ساب کالچر………………….. ۱۲۵

تصوير شماره ۲:  آزمايش  PCR براي تشخيص جنس مايکوپلاسما در نمونه ريه……………….. ۱۲۷

تصوير شماره ۳: آزمايش PCR  براي تشخيص کلاستر مايکوئيدس در نمونه ريه……………….            ۱۲۸

تصوير شماره ۴: آزمايش PCR براي تشخيص گونه آگالاکتيه درنمونه ريه………………………….  ۱۲۹

تصوير شماره ۵: آزمايش PCR براي تشخيص گونه مايکوئيدس مايکوئيدس کلوني بزرگ.. ۱۳۰

فهرست جداول

جدول۱:  طبقه بندي مايکوپلاسما………………………………………   ۱۱

جدول  ۲: معرفي اعضا کلاستر مايکوئيدس و خصوصيات بيماريزايي آنها …………………………………..   ۱۱

جدول ۳: احتياجات غذايي براي رشد مايکوپلاسماهاي کلاستر مايکوئيدس……………………………………. ۳۹

جدول ۴ : مقادير موردنياز جهت تهيه مخلوط اصلي اوليه……………………………………………………………….. ۱۱۲

جدول ۵: مواد مورد نياز واکنش تکثير ……………………………………………………………………………………………… ۱۱۴

جدول۶ : پرايمرهاي استفاده شده در واکنش تکثير …………………………………………………………………………. ۱۱۶

جدول ۷ : برنامه واکنش پرايمرها ………………………………………………………………………………………………………  ۱۱۸

جدول۸: : فرمول تهيه محيط  TBE(5X)……………………………………………………………………………………………. 120

جدول۹: ميزان اتيديوم برومايد مصرفي جهت ساختن مقادير متفاوت ژل ………………………………………. ۱۲۰

فهرست نمودارها

نمودار شماره ۱: درصد مايکوپلاسماي جدا شده به روش کشت در عفونت تنفسي

گله‌هاي مورد مطالعه……………………..  ۱۳۲

نمودارشماره ۲: درصد حضور مايکوپلاسما درعفونت تنفسي گله‌هاي مورد

مطالعه به روشPCR …………………………………………………… 132

نمودار شماره۳ : مقايسه روشهاي کشت و PCR در تشخيص  مايکوپلاسما ي موجود در عفونت تنفسي گله‌هاي مورد مطالعه   ۱۳۳

نمودار شماره۴: مقايسه نتايج کشت وPCR  نمونه‌ها در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100) …… 133

نمودار شماره ۵: مقايسه نتايج کشت و PCR مايکوپلاسما در گاو  (n=50) ………………………….  ۱۳۴

نمودار شماره ۶: مقايسه  نتايج کشت و PCR مايکوپلاسما در گله هاي  گوسفند (n=30) …..  ۱۳۴

نمودار شماره ۷: مقايسه نتايج کشت و PCR در گله‌هاي بز (n=20)……………………………………… 135

نمودار شماره۸: نمودار شماره ۸:مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR  مايکوپلاسما در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100)       ۱۳۵

نمودار شماره ۹: نمودار شماره۹:مقايسه نتايج ايجاد کدورت در محيط براث و جداسازي مايکوپلاسما در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100)       ۱۳۶

نمودار شماره ۱۰: نمودار شماره۱۰: مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR   مايکوپلاسما
در گله‌هاي گاو(n=50)……………………………………… 136

نمودار شماره ۱۱: نمودار شماره ۱۱:مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR  مايکوپلاسما
در گله‌هاي بز (n=20)……………………………. 137

نمودار شماره۱۲: مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي گوسفند (n=30)        ۱۳۷

۱۷۰ص

دامپزشکی